Erucin, hlavný izotiokyanát v rukole ( Eruca sativa ), inhibuje proliferáciu nádorových buniek MCF7 potlačením dynamiky mikrotubulov
Pridružené údaje
Abstrakt
Konzumácia hlúbovej zeleniny je spojená so zníženým rizikom rôznych druhov rakoviny. Predpokladá sa, že za túto aktivitu sú zodpovedné izotiokyanáty vrátane sulforafanu a erucínu. Erucin [1-izotiokyanato-4-(metyltio)bután], ktorý je metabolicky a štruktúrne príbuzný sulforafanu, je vo veľkom množstve prítomný v rukole ( Eruca sativa , Mill.), kalerábe a čínskej kapuste. Jeho preventívne mechanizmy proti rakovine však zostávajú nedostatočne pochopené. Zistili sme, že erucín inhibuje proliferáciu buniek rakoviny prsníka MCF7 (IC50 = 28 uM) súbežne so zastavením bunkového cyklu pri mitóze ( IC50 = 13 uM) a apoptózou, mechanizmom konzistentným s narušením dynamiky mikrotubulov. Koncentrácie 5–15 µM erucínu potláčali dynamickú nestabilitu mikrotubulov počas interfázy v bunkách. Väčšina parametrov dynamickej nestability bola potlačená, vrátane rýchlostí a rozsahu rastu a skracovania, frekvencií prepínania medzi rastom a skracovaním a celkovej dynamiky. Na zníženie hmoty mikrotubulového polyméru boli potrebné oveľa vyššie koncentrácie erucínu. Okrem toho erucín podobným spôsobom potláčal dynamickú nestabilitu mikrotubulov znovu zostavených z purifikovaného tubulínu. Účinky erucínu na dynamiku mikrotubulov, podobne ako účinky sulforafanu, sú kvalitatívne podobné účinkom oveľa silnejších klinicky používaných protirakovinových liekov zameraných na mikrotubuly, vrátane taxánov a vinca alkaloidov.
Úvod
Epidemiologické údaje ukázali, že diétna zelenina, ako je kapusta, karfiol, kel, rukola, divoká rukola a brokolica, obsahuje preventívne a protirakovinové účinky. Za tieto účinky môžu byť zodpovedné izotiokyanáty ako sulforafan a erucín [1] , [2] . Predpokladá sa, že niekoľko mechanizmov zohráva úlohu v preventívnych aktivitách izotiokyanátov proti rakovine, vrátane inhibície enzýmov aktivujúcich karcinogén fázy I [3] , [4] , indukcie enzýmov detoxikácie karcinogénu fázy II [5] , [6] , inhibície proliferácia rakovinových buniek zastavením bunkového cyklu v G2/M, a odstránenie premalígnych a malígnych buniek prostredníctvom indukcie apoptózy [7] – [10] .
Sulforafán [1-izotiokyanáto-4-(metylsulfinyl)bután] je najrozsiahlejšie študovaný izotiokyanát, ktorý sa nachádza v hlúbovej zelenine. Zvlášť výrazný je v brokolici a brokolicových klíčkoch [11] . Oveľa menej je však známe o protirakovinovej aktivite erucínu [1-izotiokyanato-4-(metyltio)butánu], štruktúrne príbuzného sulfidového analógu sulforafanu. (Obr, vložka). Krížovité šalátové plodiny, ako je rukola a divá roketa (( druhy Eruca sativa (Mill.) a Diplotaxis tenuifolia ), niekoľko odrôd čínskej kapusty a kaleráb, všetky bežne prijímané, akumulujú veľké množstvá glukoerucínu [12] – [14] a erucin je produkovaný z tohto prekurzora endogénnym enzýmom myrozináza pri krájaní alebo žuvaní zeleniny. Erucin je tiež in vivo metabolit sulforafanu, ktorý vzniká redukciou sulforafanovej tiometylovej skupiny pri konzumácii rôznych druhov kapusty, najmä brokolice a brokolicových klíčkov [15]. Vzájomná konverzia sulforafanu a erucínu je tiež priaznivou metabolickou reakciou na zvieracích modeloch a u ľudí, ktorí konzumujú buď čerstvé brokolicové klíčky alebo doplnok z brokolice [16] – [19] . Diétne izotiokyanáty sa dobre vstrebávajú a dosahujú dobrú biologickú dostupnosť [20] – [22] .
Účinky erucínu na proliferáciu buniek MCF7, mitotický index, progresiu bunkového cyklu a apoptózu.
( A ) Erucin (vložka) inhibuje proliferáciu spolu s mitotickou zástavou. Bunky sa inkubovali s rozsahom koncentrácií erucínu počas 72 hodín a vykonali sa testy bunkovej proliferácie SRB na posúdenie bunkovej proliferácie (IC50 = 28 uM, -•-). Na stanovenie mitotického indexu (IC50 = 13 uM, -•-) boli bunky inkubované s erucínom počas 24 hodín, fixované a zafarbené DAPI na vizualizáciu DNA (materiály a metódy). Údaje sú priemerom troch až štyroch nezávislých experimentov; stĺpce, ± SEM.
( B) Erucin zastavuje bunky pri G2/M. Nesynchronizované bunky boli ošetrené rozsahom koncentrácií erucínu počas 24 hodín a analyzované prietokovou cytometriou (materiály a metódy). Biele pruhy predstavujú G1 fázu, sivé pruhy, S fázu a čierne pruhy, G2/M fázu bunkového cyklu.
( C ) Erucin indukuje apoptózu závislú od času a koncentrácie. Bunky sa inkubovali s rozsahom koncentrácií erucínu počas 24 hodín (-○-) a 48 hodín (-□-) a celkový počet apoptotických buniek (skorých a neskorých apoptotických) pre každý stav sa stanovil prietokovou cytometriou (Materiály a metódy ). Výsledky sú priemer ± SEM aspoň troch nezávislých experimentov uskutočnených v duplikáte.
Rovnako ako sulforafan, erucín indukuje detoxikačné enzýmy fázy II [23] , [24] a inhibuje enzýmy fázy I [15] . Má tiež antioxidačnú aktivitu [25] a zvyšuje expresiu transportérov mnohopočetnej liekovej rezistencie v bunkových líniách ľudského karcinómu [26] . Okrem toho erucín zastavuje progresiu bunkového cyklu a indukuje apoptózu v bunkových líniách ľudského pľúcneho karcinómu, hepatómu a leukémie [27] – [30]. Všetky tieto účinky môžu hrať úlohu v protirakovinových účinkoch erucínu. Štrukturálna podobnosť medzi erucínom a sulforafanom a významnosť erucínu v niekoľkých široko konzumovaných krížových zeleninách nás viedli k skúmaniu antiproliferatívnych účinkov erucínu a jeho účinkov na polymerizáciu a dynamiku mikrotubulov v bunkách rakoviny prsníka a na dynamiku mikrotubulov. znovu zostavené z čisteného tubulínu.
Mikrotubuly sú dynamické proteínové polyméry v tvare trubice (25 nm v priemere), ktoré hrajú dôležitú úlohu pri určovaní tvaru bunky, polarity, bunkovej migrácie, signalizácie a mitózy [31] – [33] . Mikrotubuly môžu podliehať dvom nezvyčajným nerovnovážnym dynamickým správaniam, dynamickej nestabilite, prepínaniu medzi rastom a skracovaním na plusových koncoch mikrotubulov [34] , [35] a bežiacim frézovaním, montážou siete plus koncov a demontážou mínusového konca (prehľad v [31]). Dynamika mikrotubulov je počas mitózy rýchla a je kritická pre presné a časovo citlivé pripojenie chromozómov k mitotickému vretienku, pohyb chromozómov za vzniku metafázovej platne a produkciu správneho napätia v kinetochóroch, čo všetko je nevyhnutné pre prechod cez kontrolný bod vretena metafázy/anafázy [36] , [37] . Dynamika mikrotubulov je dôležitá aj pri bunkovej polarite, bunkovej migrácii a metastázovaní [33] .
Mnoho bežne používaných protirakovinových liekov pôsobí moduláciou dynamiky mikrotubulov vrátane taxánov (paklitaxel, docetaxel), vinca alkaloidov ( napr . vinblastín, vinorelbín, vinkristín), maytanzinoidov a eribulínu [38] , [39] . Na mechanickej úrovni pôsobia činidlá zacielené na mikrotubuly dvoma spôsobmi v bunkách a in vitro . Pri relatívne vysokých koncentráciách buď znižujú alebo zväčšujú hmotnosť zostavených mikrotubulov. Pri najnižších účinných koncentráciách modulujú dynamiku rastu a skracovania mikrotubulov bez ovplyvnenia hmoty polyméru mikrotubulov [38].. Väčšina zlúčenín zacielených na mikrotubuly používaných na liečbu rakoviny môže vykonávať obe aktivity, ale spravidla modulujú dynamiku mikrotubulov pri koncentráciách výrazne nižších, než sú koncentrácie potrebné na zvýšenie alebo zníženie hmoty polyméru mikrotubulov. Napríklad taxol inhibuje proliferáciu a mitózu v kultivovaných nádorových bunkách v rozsahu nízkych nanomolárnych koncentrácií potlačením dynamiky mikrotubulov, zatiaľ čo koncentrácia taxolu potrebná na výrazné zvýšenie hmoty mikrotubulového polyméru je približne 10-krát vyššia [40] . Podobne vinca alkaloidy, ktoré inhibujú polymerizáciu mikrotubulov pri vysokých koncentráciách, inhibujú bunkovú proliferáciu pri ich najnižších účinných koncentráciách zmenou dynamiky mikrotubulov bez depolymerizácie mikrotubulov [41].. Najsilnejšie účinky týchto liekov, ktoré vedú k zastaveniu bunkového cyklu pri mitóze a apoptotickej bunkovej smrti v kultivovaných bunkách, sú teda na dynamike mikrotubulov, nie na množstve zostaveného polyméru [31] , [38] , [42] .
Nedávno sme uviedli, že sulforafan inhibuje proliferáciu a mitózu v bunkách MCF7 v mikromolárnom koncentračnom rozsahu potlačením dynamiky mikrotubulov a stabilizáciou mikrotubulov podobným spôsobom, ale výrazne slabším ako pri klinicky používaných liekoch zameraných na mikrotubuly [45] . Aby sme pochopili a porovnali antiproliferatívne účinky a účinky erucínu zamerané na mikrotubuly s účinkami sulforafanu, analyzovali sme účinky erucínu na proliferáciu, progresiu bunkového cyklu, mitózu, apoptózu a dynamickú nestabilitu v bunkách rakoviny prsníka MCF7 stabilne transfekovaných vylepšenou zelenou. fluorescenčný proteín EGFP-α-tubulín. Analyzovali sme tiež účinky erucínu na polymerizáciu a dynamiku mikrotubulov zostavených z purifikovaného tubulínu in vitro. Zistili sme, že erucín inhibuje proliferáciu buniek MCF7 paralelne s inhibíciou progresie bunkového cyklu v G2/M a mitózy spôsobom konzistentným s narušením dynamiky vretenových mikrotubulov. Okrem toho erucin silne potláčal dynamiku rastu a skracovania mikrotubulov počas interfázy bez ovplyvnenia hmoty polyméru mikrotubulov a urobil to podobným spôsobom s mikrotubulmi vyrobenými z purifikovaného tubulínu in vitro . Erucin tiež zvýšil acetyláciu mikrotubulov v bunkách, čo je marker pre stabilizáciu mikrotubulov. Tieto výsledky silne podporujú hypotézu, že potlačenie dynamiky mikrotubulov erucínom je dôležité pre jeho schopnosť predchádzať rakovine.
Materiály a metódy
Činidlá
Všetky chemikálie boli zakúpené od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), pokiaľ nie je uvedené inak. Erucin (LKT Laboratories, Inc., St. Paul, MN) sa rozpustil v 100 % dimetylsulfoxide (DMSO) a skladoval sa pri -20 °C.
Bunková kultúra
Bunky ľudského adenokarcinómu prsníka MCF7 (American Type Culture Collection, ATCC # HTB 22, Manassas, VA), exprimujúce EGFP-α-tubulín (Clontech, Palo Alto, CA [43] , boli kultivované v 5 % CO2 v štandardnej glukóze Dulbecco’s Modified Eagle’s Stredná, s 10 % fetálnym hovädzím sérom (FBS, Atlanta Biologicals, Inc., Flowery Branch, GA), 1 % penicilín-streptomycín, neesenciálne aminokyseliny, pH 7,3, 37 °C. MCF7-EGFP-α-tubulínové bunky boli morfologicky nerozoznateľné od buniek MCF7. Čas zdvojenia populácie buniek bol 34 hodín v porovnaní s 29 hodinami pre nemodifikované bunky. Bunky MCF7-EGFP-a-tubulín sa označujú ako bunky MCF7.
Bunková proliferácia
Životaschopnosť buniek bola hodnotená modifikovaným sulforhodamínovým B testom (SRB) [44] . Stručne povedané, bunky sa naočkovali v množstve 2 x 104 buniek na jamku na 96-jamkové doštičky a inkubovali sa 24 hodín, aby sa umožnilo prichytenie a regenerácia buniek, inkubovali sa s erucínom alebo vehikulom počas 72 hodín, fixovali sa, zafarbili a stanovila sa optická hustota (OD ) z každej jamky (490 nm; Victor 3 V Wallac 1420 Spectrophotometer, Perkin-Elmer, Waltham, MA). Koncentrácia erucínu, ktorá inhibovala proliferáciu o 50 % (antiproliferatívna IC50 ) bola vypočítaná nasledovne: 100– [100 (OD vzorka po 72 hodinách – OD kontrola v čase nula)/(OD kontrola po 72 hodinách – OD kontrola pri nule čas)]. Výsledky sú priemer a SEM aspoň troch nezávislých experimentov.
Mitotický index, analýza bunkového cyklu, apoptóza
Bunky sa naočkovali v množstve 3 x 104 buniek na jamku (objem, 2 ml) na šesťjamkové doštičky počas 24 hodín. Potom sa kultivačné médium nahradilo erucínom alebo kontrolným vehikulom na 24 hodín. Plávajúce aj prichytené bunky sa zhromaždili a fixovali v 10 % formalíne (25 °C, 30 minút), potom nasledoval studený metanol (4 °C, 10 minút). Fixované bunky boli pripevnené na sklenené podložné sklíčka s činidlom proti vyblednutiu ProLong Gold obsahujúcim DAPI [4,6-diamidinofenylindol] (Invitrogen, Eugene, OR) a skúmané imunofluorescenčnou mikroskopiou (Nikon Eclipse E800, Melville, NY). Percento mitotických buniek sa určilo spočítaním aspoň 500 buniek pre každý stav.
Analýza bunkového cyklu sa uskutočnila pomocou prietokového cytometra Guava EasyCyte (Guava Technologies, Inc., Hayward CA) vybaveného softvérom Cytosoft 2.0. Stručne povedané, nesynchronizované bunky MCF7 sa naočkovali v množstve 6 x 104 buniek v 2 ml počas 24 hodín a inkubovali sa v neprítomnosti alebo prítomnosti erucínu počas ďalších 24 hodín, zozbierali sa, fixovali sa v studenom 70% etanole a zafarbili sa pomocou Guava Cell. Cyklujte činidlo (Guava Technologies, Inc., Hayward CA) podľa protokolu výrobcu. Pre každý stav sa meral obsah DNA najmenej 5000 buniek. Distribúcia bunkového cyklu bola analyzovaná softvérom ModFit LT 3.1 (Verity Software House, Inc., Topsham, ME). Výsledky sú priemer a SEM aspoň troch nezávislých experimentov.
Aby sa určili populácie životaschopných, mŕtvych a apoptotických buniek v prítomnosti erucínu, bunky sa inkubovali s erucínom počas 24 alebo 48 hodín. Apoptóza bola stanovená pomocou súpravy Guava Nexin podľa protokolu výrobcu na prietokovom cytometri Guava EasyCyte (Guava Technologies, Inc., Hayward CA). Údaje boli analyzované pomocou softvéru Guava Technologies. Výsledky sú priemery a SEM aspoň troch nezávislých experimentov pre každý stav.
Imunofluorescenčná mikroskopia
Bunky boli nasadené na krycie sklíčka ošetrené poly-L-lyzínom v množstve 6 x 104bunky v 2 ml na jamku v šesťjamkových doštičkách počas 24 hodín, inkubované s erucínom alebo kontrolným vehikulom (24 hodín), fixované v 10 % formalíne v PBS (20 minút, 25 °C) a následne 10 minút v metanole (4 °C C), premyté PBS a inkubované s 1 % normálnym kozím sérom (30 minút). Bunky sa potom inkubovali s myšou DM1 anti-a-tubulínovou protilátkou (1∶1000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) počas 1 hodiny pri 37 °C, premyli sa 3x v PBS obsahujúcom 1 % hovädzieho sérového albumínu a nasledovala inkubácia s kozia anti-myšia FITC-konjugovaná sekundárna protilátka (1∶1000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) počas 1 hodiny pri 37 °C. Po umytí boli krycie sklíčka pripevnené na sklenené sklíčka s činidlom proti vyblednutiu ProLong Gold s DAPI (Life Technologies, Grand Island, NY) na vizualizáciu jadier a bunky boli zobrazené digitálnym fotoaparátom Photometrics CoolSNAP HQ (Tucson, AZ).
Analýza acetylácie mikrotubulov
Na analýzu stupňa acetylácie mikrotubulov boli bunky ošetrené a fixované ako je uvedené vyššie a mikrotubuly boli vizualizované primárnym králičím anti-a-tubulínom (1∶400, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a sekundárnym oslim anti-králičím Rho (1∶150, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA). Acetylované mikrotubuly boli vizualizované myšou anti-a-acetylovanou tubulínovou primárnou protilátkou (1∶500, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a sekundárnou kozou anti-myšou-FITC-konjugovanou protilátkou (1∶1000, Sigma-Aldrich , St. Louis, MO). Rozsah acetylácie mikrotubulov v neprítomnosti a prítomnosti 15 uM a 30 uM erucínu sa analyzoval pomocou softvéru ImageJ. Konkrétne sa intenzita fluorescencie acetylovaných mikrotubulov (zelený kanál) v najmenej 25 medzifázových bunkách MCF7 na podmienky analyzovala podľa vzorca: korigovaná celková bunková fluorescencia (CTCF) = Hrubá stredná integrovaná hustota – (plocha vybranej bunky × priemerná intenzita fluorescencie pozadia). Analyzovali sa len ploché a dobre rozložené bunky. Mitotické bunky nebolo možné analyzovať, pretože boli príliš malé a okrúhle so škvrnou koncentrovanou v malých oblastiach. Vysoké koncentrácie erucínu (50 uM a viac) vyvolali značnú depolymerizáciu mikrotubulov a väčšina buniek bola tiež okrúhla, čo znemožňovalo presné meranie.
Zobrazovanie živých buniek a analýza dynamickej nestability mikrotubulov v medzifázových bunkách MCF7
Analýza dynamickej nestability mikrotubulov sa uskutočnila tak, ako bolo opísané vyššie [45] . MCF7-EGFP-a-tubulínové bunky sa naočkovali na šesťjamkové platne (6×104 buniek /2 ml/jamka) na krycie sklíčka potiahnuté poly-L-lyzínom, laminínom a fibronektínom počas 24 hodín v kultivačnom médiu s 10 % FBS a potom 24 hodín v kultivačnom médiu s 2 % FBS, aby sa vyvolalo sploštenie, potom sa pridal erucín v požadovaných koncentráciách na ďalších 24 hodín. Video časozberné snímky mikrotubulov v tenkých periférnych oblastiach buniek boli zaznamenané tak, ako bolo opísané vyššie [45].. Nasnímalo sa 30 až 36 snímok v 4-sekundových intervaloch pomocou objektívu 100X Nikon Plan Apo (37±1 °C) na mikroskope Nikon Eclipse E800 s kamerou CoolSNAP HQ2 (Roper Scientific GmbH, Nemecko) pod kontrolou softvéru MetaMorph 4.9. (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA). Polohy plusových koncov boli sledované a graficky znázornené ako dĺžka mikrotubulov vs. časové grafy „životnej histórie“ a parametre dynamickej nestability sa určili tak, ako bolo opísané vyššie. Zmeny dĺžky ≥ 0,5 μm medzi dvoma časovými bodmi sa považovali za udalosti rastu alebo skracovania. Zmeny dĺžky < 0,5 µm sa považovali za obdobia zoslabenej dynamiky alebo pauzy. Katastrofická frekvencia je frekvencia prechodu z rastového alebo oslabeného (pozastaveného) stavu do skracovania. Záchranná frekvencia je frekvencia prechodu zo skracovania do rastu alebo zoslabeného (pozastaveného) stavu. Dynamika je súčet všetkých rastúcich a skracujúcich sa udalostí vydelený celkovým nameraným časom, vrátane času stráveného v zoslabenom stave.
Purifikácia mikrotubulového proteínu a tubulínu
Proteín mikrotubulov pozostávajúci zo 70 % tubulínu a 30 % proteínov spojených s mikrotubulami (MAP) sa izoloval z hovädzích mozgov a tubulín zbavený MAP (čistota > 99 %) sa čistil pomocou fosfocelulózovej stĺpcovej chromatografie a skladoval sa pri -70 °C, ako už bolo opísané [46 ] . Na experimenty sa purifikovaný tubulín rozmrazil a centrifugoval pri 4 °C (35 000 ot./min.), aby sa odstránil akýkoľvek agregovaný alebo denaturovaný tubulín (Optima Max Ultracentrifúga, Beckman Coulter).
Zostavenie mikrotubulov a stanovenie hmotnosti polyméru mikrotubulov v ustálenom stave
Purifikovaný tubulín bez MAP (2,75 mg/ml) sa polymerizoval v PEM pufri [100 mM PIPES, 36 mM MES, 1,4 mM MgCl2 , 1 mM EGTA a 1 mM GTP pH 6,8] v neprítomnosti alebo prítomnosti erucínu počas 35 min pri 35 °C a potom sa začalo zostavovanie so suspenziou strihaných nukleačných mikrotubulových semien pripravených v 10 % DMSO a 10 % glycerole [45]. Konečný objem suspenzie semien k roztoku tubulínu bol 1∶50. Reakčné zmesi sa polymerizovali ďalších 60 minút pri 35 °C, aby sa dosiahol takmer rovnovážny stav, a mikrotubulová polymerizácia sa monitorovala turbidimetricky pri 350 nm s použitím teplotne riadeného spektrofotometra Beckman DU 640. Na stanovenie hmotnosti polyméru mikrotubulov sa mikrotubuly zostavené podľa vyššie uvedenej reakcie peletovali centrifugáciou pri 35 000 ot./min. počas 1 hodiny pri 35 °C (ultracentrifúga Optima Max). Mikrotubulové pelety sa solubilizovali v 0,2 M NaOH pri 4 °C, aby sa stanovila koncentrácia proteínu [45] .
Účinky erucínu na dynamickú nestabilitu purifikovaných mikrotubulov
Správanie dynamickej nestability na plusových koncoch jednotlivých purifikovaných mikrotubulov sa analyzovalo pomocou video-zosilnenej diferenciálnej interferenčnej kontrastnej mikroskopie, ako bolo opísané vyššie [47] . Stručne, purifikovaný tubulín z hovädzieho mozgu sa zmiešal so semenami axonémy morského ježka a polymerizoval sa do ustáleného stavu na koncoch semien (30 minút, 35 °C) v PMME pufri [87 mM PIPES, 36 mM kyselina 2-morfolinoetánsulfónová, 1,8 mM MgCl 2 , 1 mM EGTA, 1 mM GTP, pH 6,8] v prítomnosti alebo neprítomnosti erucínu. Mikrotubuly sa zaznamenávali až 60 minút na sklíčko. Dĺžky mikrotubulov sa merali každých 3–5 s, vyniesli sa do grafu ako dĺžka versus čas a analyzovali sa pomocou softvéru Real-Time Measurement, ako je opísané v [45] , [47] .
Výsledky
Erucin inhibuje proliferáciu buniek MCF7 v spojení s inhibíciou progresie bunkového cyklu v G2/M a inhibíciou mitózy
Erucin (Obr. 1A, vložka) inhibovala proliferáciu buniek MCF7 spôsobom závislým od koncentrácie s 50 % inhibíciou (IC50 ) vyskytujúcou sa pri koncentrácii 28 uM (72 hodín inkubácie, materiály a metódy,Obr. 1A, -•-). Inhibícia proliferácie sa vyskytla v štádiu G2/M bunkového cyklu, ako bolo stanovené prietokovou cytometriou. Konkrétne 29 % populácie kontrolných buniek bolo v G2/M, čo je v súlade s predtým publikovanými výsledkami s týmito bunkami (Obr. 1B) [45] . Po 24 hodinách inkubácie bolo 50 % buniek v G2/M pri 5 uM erucínu, 60 % pri 15 uM erucínu a 69 % pri 25 uM (Obr. 1B, čierne pruhy). Tieto účinky sú veľmi podobné účinkom sulforafanu, ktorý inhiboval proliferáciu buniek MCF7 pri IC50 26 uM a vyvolal 64 % akumuláciu buniek pri G2/M pri koncentrácii 25 uM [45] .
Inhibícia progresie bunkového cyklu v G2M erucínom bola spojená s mitotickou zástavou (ObrA, -•-). Konkrétne sa polovica maximálnej akumulácie buniek v mitóze po 24 hodinách vyskytla pri 13 uM erucínu a maximálna mitotická akumulácia (približne 32–33 %) sa vyskytla pri 25 uM erucínu. Inhibičné účinky erucínu na mitózu v bunkách MCF7 boli podobné tým, ktoré boli predtým opísané pre sulforafan, ktorý indukoval polovicu maximálnej akumulácie buniek v mitóze pri koncentrácii 13 µM [45] .
Indukcia apoptózy Erucínom
Podobne ako sulforafan, erucín indukoval apoptózu v bunkách spôsobom závislým od času a koncentrácie (ObrC, pozri [45] ). Konkrétne v kontrolných bunkách bolo 3,7 % a 4,2 % apoptotických buniek po 24 a 48 hodinách. Avšak v prítomnosti 25 uM erucínu, čo je koncentrácia približne dvojnásobok IC50 na inhibíciu mitózy, došlo k 4,8- a 8,6-násobnému zvýšeniu počtu apoptotických buniek po 24 a 48 hodinách v porovnaní s kontrolami. Rozsah apoptickej bunkovej smrti sa zvyšoval s vyššími koncentráciami erucínu a dosiahol približne 25 % po 24 hodinách a 45 % po 48 hodinách v porovnaní s 3,7 % (24 hodín) a 4,2 % (48 hodín) u kontrol (ObrC).
Účinky erucínu na medzifázovú sieť mikrotubulov a morfológiu mitotických vretien
Na stanovenie účinkov erucínu na medzifázovú sieť mikrotubulov a na morfológiu mitotických vretien boli bunky MCF7 fixované a zafarbené na mikrotubuly a chromatín a skúmané imunofluorescenčnou mikroskopiou (Obr, Materiály a metódy). Mikrotubuly v kontrolných medzifázových bunkách vytvorili jemnú vláknitú sieť v celej cytoplazme, ktorá vychádzala z centra organizujúceho mikrotubuly (ObrA). Koncentrácie erucínu až 15 µM (24-hodinová inkubácia) detegovateľne nezmenili organizáciu medzifázových mikrotubulov a samotné mikrotubuly boli na nerozoznanie od tých v kontrolných medzifázových bunkách (ObrD). Naopak, v prítomnosti 30 uM erucínu, čo je koncentrácia, ktorá vytvára približne maximálnu mitotickú akumuláciu, bolo menej mikrotubulov ako v kontrolných bunkách a tie, ktoré zostali, boli krátke a zakrivené (ObrG). Pri vysokých koncentráciách erucínu (≥50 µM) sa väčšina buniek zaguľatila a mikrotubuly boli krátke a čiastočne depolymerizované (ObrJ). Tieto účinky sú veľmi podobné účinkom sulforafanu [45] a podobajú sa účinkom iných činidiel depolymerizujúcich mikrotubuly, ako sú alkaloidy vinca (pozri diskusiu [42] ).
Koncentračná závislosť účinkov erucínu na morfológiu bunkových mikrotubulov, morfológiu vretienka a acetyláciu mikrotubulov v bunkách MCF7.
( A ) Interfázové kontrolné bunky, ( D ) 15 uM, ( G ) 30 uM, ( J) 50 uM a ( K ) 25 uM erucín (mnohojadrová bunka). Kontrolné bunky a bunky inkubované s 15 uM erucínu vykazujú neporušené siete mikrotubulov s podobnou celkovou morfológiou. Pri 30 uM erucínu boli mikrotubuly o niečo kratšie, ich počet bol znížený a boli veľmi zakrivené. Pri 50 uM erucínu bola väčšina mikrotubulov depolymerizovaná so zvyšnými mikrotubulami zoskupenými okolo jadra. Erucin tiež indukoval obrovské viacjadrové bunky ( K , 25 uM erucin) pri nízkych a najmä pri vysokých koncentráciách (údaje nie sú uvedené). Metafázové vretienka v kontrolných bunkách ( B) boli bipolárne so všetkými chromozómami sústredenými na metafázovú platňu. Väčšina buniek zastavených v mitóze erucínom vykazovala určité abnormality v metafáze: slabo definované bipolárne vretienka s nekongresovanými chromozómami (( E ) 15 µM erucínu, šípka) a zvýšeným počtom astrálnych mikrotubulov (( E ) 15 µM erucínu, šípky), alebo monopolárne vretienka, ktoré obsahovali veľa nekongresových chromozómov (( H ) 25 uM erucínu, šípka). A, B, D, E, G, H, J a K : chromozómy sú modré, mikrotubuly sú zelené. C, F, I, L: acetylované mikrotubuly v prítomnosti 0–100 uM erucínu. Erucin podporuje acetyláciu mikrotubulov v bunkách MCF7 spôsobom závislým od koncentrácie. ( C) V kontrolných bunkách je väčšina mikrotubulov dynamická (červená farba) s veľmi malým počtom acetylovaných mikrotubulov (zelené mikrotubuly). ( F ) Pri 15 uM erucínu bolo viac stabilizovaných (acetylovaných) mikrotubulov v porovnaní s tými v kontrolách. ( I ) Pri 30 uM erucínu (približne 2 x mitotické IC50 ) bolo menej mikrotubulov a väčšina zostávajúcich mikrotubulov bola zakrivená a acetylovaná (zelená). ( L ) V prítomnosti 50 uM erucínu bola väčšina mikrotubulov depolymerizovaná a silne acetylovaná. Celkovo bola dynamika mikrotubulov významne stabilizovaná erucínom, čím sa znížil obrat mikrotubulov. C, F, I, L:chromozómy sú modré, mikrotubuly sú červené, acetylované mikrotubuly sú zelené. Mierka je 10 µm.
Mitotické vretienka v kontrolných bunkách vykazovali dobre vytvorené bipolárne mitotické vretienka so všetkými chromozómami v bunkách metafázy sústredenými do kompaktnej centrálnej oblasti medzi dvoma dobre oddelenými pólmi vretienka (ObrB). Normálne vretená tiež vykazovali veľmi málo astrálnych mikrotubulov na póloch vretena. Erucin vyvolal štrukturálne a funkčné abnormality vretienka v koncentráciách, ktoré detegovateľne nezmenili medzifázovú organizáciu mikrotubulov. Pri 15 uM erucínu sa približne 5 % metafázových vretien zdalo normálnych so správne duplikovanými a oddelenými centrozómami, kompaktnou metafázovou doskou bez zaostávajúcich chromozómov a veľmi malým počtom astrálnych mikrotubulov na póloch vretienka (údaje nie sú uvedené). Približne 25 % vretien bolo stále bipolárnych pri 15 µM erucínu, ale vykazovali abnormality, ako napríklad niekoľko nekongresových chromozómov umiestnených na póloch vretienka (ObrE, hrot šípky). Na rozdiel od mitotických vretien v kontrolných bunkách, ktoré obsahovali len niekoľko astrálnych mikrotubulov, vretienka ošetrené erucínom vykazovali relatívne vysoký počet astrálnych mikrotubulov (ObrE, šípka). Približne 70 % zastavených mitotických buniek vykazovalo chromozómy, ktoré boli usporiadané do gule obklopujúcej monopolárne vretienka, v ktorých centrozómy neboli správne oddelené (ObrE). Pri 25 µM erucínu, koncentrácii, ktorá vyvolala najvyšší stupeň mitotického zastavenia (mitotický index 32,5 %), prevládali monopolárne vretienka s nekongresovanými chromozómami (ObrH, šípka), mikrotubuly vretienka vychádzali zo stredu monopolárnych vretien (ObrH, šípka) a počet obrovských viacjadrových buniek sa zvýšil na približne 15,6 % (13-krát) v porovnaní s 1,2 % u kontrol (ObrK). Aberácie mitotického vretienka indukované erucínom boli veľmi podobné aberáciám indukovaným sulforafanom [45] . Je zaujímavé, že liečivá zacielené na mikrotubuly, ako sú taxány a alkaloidy vinca, spôsobujú podobné abnormality vretena (pozri diskusiu, prehľad v [38] ).
Pomer počtu buniek v anafáze k počtu buniek v metafáze počas mitózy je odrazom prechodu bunky cez prechod z metafázy do anafázy. Pomer anafáza/metafáza v kontrolných bunkách bol 0,55. Naopak, pri 15 uM erucínu bol pomer anafáza/metafáza iba 0,09, čo je 6-násobný pokles, čo naznačuje, že erucín silne spomaľuje alebo zabraňuje bunkám v prechode z metafázy do anafázy. Vyskytuje sa to aj pri sulforafanu a je podobné tomu, čo sa vyskytuje pri účinnejších liekoch zameraných na mikrotubuly, ako sú taxol a alkaloidy vinca [48] .
Účinky erucínu na dynamickú nestabilitu mikrotubulov a obrat v medzifázových bunkách MCF7
Zatiaľ čo erucín na IC50 pre mitotickú zástavu detegovateľne neovplyvnil organizáciu a/alebo štruktúru mikrotubulov počas interfázy, silne ovplyvnil správanie sa dynamickej nestability mikrotubulov. Typické obrázky interfázových mikrotubulov v kontrolných bunkách sú uvedené vObrA (panel horného radu) a mikrotubuly v bunkách inkubovaných s 15 uM erucínu počas 24 hodín sú znázornené naObrB (panel spodného riadku). V kontrolných bunkách sa plusové konce mikrotubulov (označené šípkami a šípkou) normálnym spôsobom striedali medzi obdobiami relatívne pomalého rastu, rýchleho skracovania a pauzy, čo je stav zoslabenej dynamickej aktivity, ktorá je pod rozlišovacou schopnosťou mikroskopu. Mikrotubuly v kontrolných bunkách rástli priemernou rýchlosťou 14,5 ± 1,07 um/min a skracovali sa rýchlosťou 22,4 ± 1,7 um/min. Mikrotubuly kontrolných buniek tiež strávili približne 42 % svojho celkového času v pozastavenom alebo oslabenom stave, pričom ani nerástli, ani sa detegovateľne neskracovali (stôl 1).
Dynamická nestabilita mikrotubulov v bunkách MCF7 inkubovaných s erucínom.
Časozberné sekvencie fluorescenčných mikrotubulov na ich plusových koncoch: polohy plus koncov mikrotubulov boli sledované v priebehu času, aby sa vytvorili grafy histórie života v neprítomnosti ( A ) alebo prítomnosti ( B ) 15 uM erucínu, z ktorých boli parametre dynamickej nestability vypočítané. Väčšina mikrotubulov v kontrolných bunkách rástla ( A , šípky) a skracovala sa ( A , šípky) v priebehu 2-minútového obdobia pozorovania. Dynamika bola významne potlačená 15 uM erucínu ( B ). Stĺpec = 5 um. ( C) Potlačenie parametrov dynamiky mikrotubulov v bunkách MCF7 erucínom závislé od koncentrácie: rýchlosť rastu (♦), dĺžka rastu (◊), rýchlosť skracovania (•), dĺžka skracovania (□) a dynamika (×). Údaje sú zstôl 1.
stôl 1
| ERUCIN (µM) | |||||||
| PARAMETER | 0 | 5 | % zmeny | 10 | % zmeny | 15 | % zmeny |
| Rýchlosť rastu (µm/min) | 14.5±1.0 | 14.2±1.0 | −2 | 12.0±0.8 | −17 | 10.3±0.6** | −29 |
| Rýchlosť skracovania (µm/min) | 22.4±1.7 | 15.5±0.7* | −31 | 10.4±0.8** | −54 | 9.6±0.7** | −57 |
| Dĺžka rastu (µm) | 3.3±0.3 | 3.8±0.3 | +15 | 3.4±0.3 | −3 | 2.3±0.1* | −30 |
| Dĺžka skrátenia (µm) | 4.7±0.6 | 2.3±0.2** | −51 | 2.2±0.2** | −53 | 1.5±0.1** | −68 |
| Trvanie útlmu (min) | 0.27±0.02 | 0.35±0.04* | +30 | 0.35±0.02* | +30 | 0.38±0.04* | +41 |
| Rastúci čas (%) | 29.5 | 39.7 | 40.0 | 35.9 | |||
| Skrátenie času (%) | 28.6 | 28.3 | 22.5 | 20.1 | |||
| Časový útlm (%) | 41.9 | 32.0 | 37.5 | 44.0 | |||
| Katastrofická frekvencia, #/min | 2.0±0.2 | 1.8±0.2 | −10 | 1.6±0.1* | −20 | 1.4±0.1** | −30 |
| Záchranná frekvencia, #/min | 4.4±0.5 | 4.0±0.4 | 0 | 4.3±0.4 | −2 | 5.6±0.4** | +27 |
| Dynamika (µm/min) | 10.6±0.4 | 8.7±0.8* | −18 | 7.2±0.3** | −32 | 5.7±0.5** | −46 |
| Nedynamické mikrotubuly (%) | 5 | 27 | 46 | 58 | |||
Erucin silne potláčal parametre dynamickej nestability mikrotubulov spôsobom závislým od koncentrácie (ObrB, C). Kvantifikovali sme účinky 5–15 uM erucínu (24-hodinová inkubácia) na dynamickú nestabilitu medzifázových mikrotubulov, ktoré vykazovali dynamickú aktivitu. Je pozoruhodné, že približne 60 % mikrotubulov bolo silne stabilizovaných pri 15 uM erucínu. Ako je uvedené vstôl 1aObrC, 15 uM erucínu znížilo rýchlosť rastu a dĺžku rastu počas rastu o 29 % a 30 %, v danom poradí. Účinnejšie potlačila rýchlosť skracovania a dĺžku skracovania (o 57 %, resp. 68 %). Frekvencia katastrof na základe času sa znížila o 30 %, frekvencia záchrany sa zvýšila o 27 % a celková dynamika bola potlačená o 46 % (stôl 1). Účinné potlačenie dynamiky a stabilizácia mikrotubulov v bunkách MCF7 erucínom silne pripomína účinky sulforafanu v týchto bunkách [45] .
Acetylácia tubulínu v mikrotubuloch je markerom obratu a stability mikrotubulov, pričom zvýšená acetylácia koreluje so zníženým obratom a zvýšenou stabilitou [49] . Účinky erucínu znázornené pomocou protilátky proti acetylovanému α-tubulínu sú znázornené na (ObrC, F, I, L). V kontrolných bunkách bolo acetylovaných niekoľko mikrotubulov, zatiaľ čo inkubácia buniek s erucínom počas 24 hodín viedla k významnému zvýšeniu v závislosti od koncentrácie v rozsahu acetylácie mikrotubulov (ObrF, I, L, obr. S1 ). Konkrétne, acetylácia mikrotubulov založená na intenzite zafarbenia acetylovaného tubulínu v mikrotubuloch po ošetrení 15 a 30 uM erucínom sa zvýšila približne 3 a 4,4 násobne v porovnaní s kontrolnými bunkami ( obr. S1 ). Pri vysokých koncentráciách erucínu (50 µM) bola väčšina mikrotubulov depolymerizovaná a zvyšné mikrotubuly boli vysoko acetylované a (ObrL), čo bráni presnému hodnoteniu acetylácie v týchto bunkách. Podobné výsledky sa získali so sulforafanom [45] a s ďalším liekom destabilizujúcim mikrotubuly, estramustínom [50] . Takže pri koncentráciách erucínu, ktoré inhibovali mitózu, ale neovplyvnili množstvo alebo usporiadanie mikrotubulov v bunkách MCF7 počas interfázy (≤ 15 uM), erucín napriek tomu potlačil dynamiku mikrotubulov. Je rozumné si myslieť, že takéto potlačenie dynamiky mikrotubulov narúša funkcie interfázových mikrotubulov, ako sú ich kritické úlohy pri migrácii buniek a metastázach (pozri diskusiu).
Účinky erucínu na polymerizáciu a dynamiku mikrotubulov zostavených z purifikovaného tubulínu
Inhibícia polymerizácie mikrotubulov liečivami destabilizujúcimi mikrotubuly ( napr . vinka alkaloidmi) si vyžaduje oveľa vyššie koncentrácie liečiva, ako sú koncentrácie potrebné na potlačenie dynamiky mikrotubulov [38] , [42] . Toto sa vyskytuje aj pri erucíne. Erucin inhiboval polymerizáciu purifikovaného hovädzieho mozgového tubulínu na mikrotubuly, ale robil to relatívne slabo (Obr). Konkrétne 15 uM erucínu výrazne nezmenilo rýchlosť alebo rozsah polymerizácie mikrotubulov (ObrA), zatiaľ čo 25 uM erucín len čiastočne inhiboval rozsah polymerizácie (10,9 ± 1 %, štatisticky nevýznamné,ObrB). Značné zníženie hmoty mikrotubulového polyméru si vyžadovalo veľmi vysoké koncentrácie erucínu (≥50 µM) s takmer úplnou inhibíciou polymerizácie, ku ktorej dochádza pri 100 µM erucínu (najvyššia testovaná koncentrácia,Obr). Tiež vysoké koncentrácie erucínu > 75 uM indukovali tvorbu tubulínových agregátov, ako bolo stanovené elektrónovou mikroskopiou (údaje nie sú uvedené).
Erucin inhibuje polymerizáciu tubulínu in vitro .
( A ) Polymerizácia purifikovaného tubulínu (2,75 mg/ml), predinkubovaného s liečivom alebo bez liečiva počas 35 minút, sa uskutočnila pri 35 °C iniciáciou s nukleačnými mikrotubulovými semenami (materiály a metódy) v neprítomnosti (□) kontrola alebo prítomnosť (◊) 15, (o ) 25, (•) 50 uM a (A) 100 uM erucínu počas 60 minút. ( B ) Celková hmotnosť mikrotubulového polyméru bola stanovená centrifugáciou 60 minút po začatí zostavovania. Stĺpce sú ± SEM. Hodnoty s * sa významne líšia od kontroly pri ≥95 % intervale spoľahlivosti podľa Studentovho t -testu.
Podobne ako pri jeho pôsobení v bunkách MCF7, koncentrácie erucínu, ktoré neboli dostatočne vysoké na to, aby ovplyvnili rýchlosť alebo rozsah zostavovania purifikovaných mikrotubulov (≤15 uM erucínu), silne potlačili dynamickú nestabilitu týchto mikrotubulov na ich plusových koncoch spôsobom závislým od koncentrácie. (Tabuľka 2, Obr, Materiály a metódy). Ako je uvedené vObrA, kontrolné mikrotubuly prešli pomalým rastom a rýchlym skrátením a strávili relatívne málo času v oslabenom stave (každá čiara predstavuje jeden mikrotubulus). Na rozdiel od toho pri 15 uM erucínu boli mikrotubuly silne stabilizované, rástli a skracovali sa pomalšie ako kontrolné mikrotubuly, pričom trávili viac času v oslabenom (pozastavenom) stave (ObrB).
Potlačenie dynamickej nestability na plus-koncoch mikrotubulov in vitro erucínom závislé od koncentrácie.
Konce mikrotubulov boli sledované v priebehu času, aby sa vytvorili grafy histórie života jednotlivých mikrotubulov zostavených in vitro z purifikovaného tubulínu z hovädzieho mozgu. Grafy životnej histórie sú zmeny dĺžky jednotlivých mikrotubulov v kontrolách ( A ) a v prítomnosti 15 uM erucínu ( B ) . ( C ) Potlačenie parametrov dynamiky mikrotubulov in vitro erucínom závislé od koncentrácie: rýchlosť rastu (♦), dĺžka rastu (◊), rýchlosť skracovania (•), dĺžka skracovania (□) a dynamika (×). Údaje sú zTabuľka 2.
Tabuľka 2
| ERUCIN (µM) | |||||||
| PARAMETER | 0 | 5 | % zmeny | 10 | % zmeny | 15 | % zmeny |
| Rýchlosť rastu (µm/min) | 0.56±0.1 | 0.55±0.2 | −2 | 0.49±0.05 | −13 | 0.38±0.02** | −32 |
| Rýchlosť skracovania (µm/min) | 21.1±4.6 | 16.5±2.9* | −22 | 11.9±3.5** | −44 | 9.80±1.7** | −54 |
| Dĺžka rastu (µm) | 1.0±0.1 | 0.9±0.1 | −10 | 0.6±0.1** | −40 | 0.50±0.1** | −50 |
| Dĺžka skrátenia (µm) | 4.2±0.5 | 3.7±0.2 | −12 | 2.9±0.1** | −31 | 2.0±0.1** | −52 |
| Trvanie útlmu (min) | 0.9±0.1 | 0.9±0.2 | 0 | 1.2±0.1* | +33 | 1.5±0.1** | +67 |
| Rastúci čas (%) | 68.7 | 59.8 | 38.2 | 32.1 | |||
| Skrátenie času (%) | 8.5 | 11.0 | 12.3 | 12.9 | |||
| Časový útlm (%) | 22.8 | 29.2 | 49.5 | 55.0 | |||
| Katastrofická frekvencia, #/min | 0.3±0.1 | 0.3±0.2 | 0 | 0.26±0.1 | −13 | 0.2±0.1* | −33 |
| Záchranná frekvencia, #/min | 3.3±0.9 | 3.2±0.4 | −3 | 3.70±0.5 | +12 | 4.0±0.4* | +21 |
| Dynamika (µm/min) | 1.5 | 1.2 | −20 | 0.8 | −47 | 0.4 | −73 |
Konkrétne, 15 uM erucínu znížilo rýchlosť rastu a dĺžku pestovanú počas rastu približne o 32 % a 50 %, v tomto poradí (Tabuľka 2, ObrC). Znížila tiež strednú mieru skrátenia o 54 %, dĺžku exkurzie skrátenia o 52 %, frekvenciu katastrof o 33 % a frekvenciu záchrany o 21 %. Zvýšil podiel času, ktorý mikrotubuly strávili v oslabenom stave (z 23 % v kontrolách na 55 %) a znížil celkovú dynamiku mikrotubulov o 73 % (Tabuľka 2, ObrC). Tieto účinky erucínu na parametre dynamickej nestability purifikovaných mikrotubulov sú kvalitatívne podobné jeho účinkom na dynamické parametre mikrotubulov v živých interfázových bunkách MCF7, čo naznačuje, že účinky erucínu na dynamiku mikrotubulov v bunkách sú spôsobené priamym pôsobením na mikrotubuly. (stôl 1,,22).
Diskusia
Skúmali sme antimitotický a antiproliferatívny mechanizmus účinku erucínu, hlavného izotiokyanátu prítomného v druhoch rukolového šalátu ( napr . rukola a divoká rukola). Zistili sme, že v bunkách MCF7 pôsobí erucín veľmi podobne ako štruktúrne príbuzný izotiokyanát sulforafan [45] . Hlavné bunkové účinky Erucínu sú (a) inhibícia bunkovej proliferácie; (b) zastavenie bunkového cyklu pri G2/M; (c) potlačenie dynamickej nestability mikrotubulov v interfázovej cytoplazme buniek; (d)a indukcia apoptózy. Okrem toho účinky erucínu na dynamiku a polymerizáciu mikrotubulov vyrobených z purifikovaného tubulínu boli podobné ako v bunkách, čo naznačuje, že jeho účinky na dynamiku mikrotubulov v bunkách sú spôsobené priamym pôsobením na mikrotubuly.
Účinky erucínu na mitotické vretená
Erucin inhiboval proliferáciu buniek MCF7 spôsobom závislým od koncentrácie s IC50 28 uM a zastavil progresiu bunkového cyklu pri mitóze s približne podobnou IC50 ( 13 uM), čo naznačuje, že inhibícia proliferácie erucínom je spojená s inhibíciou mitózy. Podobne ako pri pôsobení sulforafanu sa zdá, že inhibícia mitózy erucínom je spôsobená potlačením dynamiky vretienkových mikrotubulov. Inhibícia mitózy erucínom sa vyskytla v prometafáze/metafáze a bola sprevádzaná tvorbou abnormálnych bipolárnych a monopolárnych vretien s nesprávne distribuovanými chromozómami (Obr). Napríklad pri 15 µM erucínu malo veľa zastavených mitotických vretien takmer normálny komplement mikrotubulov, ale jeden alebo niekoľko chromozómov zostávajúcich na póloch vretena, ktoré sa nemohli presunúť na metafázovú platňu (ObrE). Monopolárne vretienka prevládali pri 25 uM erucínu, čo je koncentrácia, ktorá vyvolala maximálnu mitotickú akumuláciu (mitotický index približne 32 %) (ObrF), čo naznačuje, že pri tejto koncentrácii bunky neboli schopné vybudovať a / alebo udržať funkčné bipolárne vreteno.
Je príznačné, že bunky zastavené pri mitóze erucínom, ktoré vykazovali abnormálne organizácie chromozómov a vretienkových mikrotubulov podobné tým, ktoré indukoval sulforafan [45] , boli tiež podobné abnormálnym vretienkam indukovaným silnejšími protirakovinovými liekmi zameranými na mikrotubuly, ako sú taxány a vinca alkaloidy. [42] , [51] . Potlačenie dynamiky mikrotubulov vretienka týmito liekmi spôsobuje niekoľko dobre zdokumentovaných účinkov na organizáciu a funkciu mitotického vretienka [38] , [41].. Narúšajú organizáciu vretienkových mikrotubulov a bránia chromozómom správne sa pripojiť k vretenovým mikrotubulom a presúvať sa na metafázovú platňu. Napríklad v bunkách Hela nízke koncentrácie vinca alkaloidov (0,2–30 nM) indukujú tvorbu vretien s dlhšími a výraznejšími astrálnymi mikrotubulami ako v normálnych vretienkach, často s jedným alebo viacerými chromozómami na jednom alebo oboch póloch vretienka a nie na metafázová platňa [41] . To isté sa deje s taxánmi [52] , maytanzinoidmi [53] a eribulínom [39] .
Potlačenie dynamiky chemoterapeutickými liekmi zameranými na mikrotubuly znižuje napätie na kinetochóroch chromozómov a bunky nedokážu splniť kontrolný bod zostavenia mitotického vretienka. Bunky podliehajú predĺženej mitotickej zástave a/alebo aberantnému mitotickému odchodu spojenému s tvorbou viacjadrových buniek a nakoniec odumierajú apoptózou [51] , [54]. V skutočnosti, podobne ako liečivá zacielené na mikrotubuly a jeho analóg sulforafan, erucin indukoval tvorbu viacjadrových buniek, pričom počet takýchto buniek sa zvýšil 13-násobne pri 25 uM erucínu (15,6 % v porovnaní s 1,2 % u kontrol). Ošetrenie erucínom tiež viedlo k indukcii apoptózy závislej od času a koncentrácie, pričom 25 uM erucínu zvýšilo apoptózu z približne 4 % u kontrol na 18 % po 24 hodinách a na 31 % po 48 hodinách.
Účinky erucínu na polymerizáciu mikrotubulov a dynamickú nestabilitu
Na ďalšiu podporu myšlienky, že erucín zastavuje proliferáciu buniek pri mitóze narušením dynamiky mikrotubulov, sme priamo určili, že potláča dynamickú nestabilitu mikrotubulov v periférnych oblastiach buniek MCF7 počas interfázy. Konkrétne, 15 uM erucín (koncentrácia blízka IC50 pre inhibíciu mitózy) inhiboval väčšinu parametrov dynamickej nestability normálne zobrazovaných mikrotubulami, vrátane rýchlosti a rozsahu rastu a skracovania a frekvencií prechodu medzi rastom a skracovaním (stôl 1). Erucin tiež zvýšil rozsah acetylácie interfázových mikrotubulov (ObrF, I, L; Obr. S1 ), indikátor zníženého obratu mikrotubulov a stabilizovanej dynamiky [55] , [56] .
Erucin tiež potláčal dynamickú nestabilitu mikrotubulov vyrobených z purifikovaného tubulínu in vitro spôsobom takmer na nerozoznanie od spôsobu, akým potláčal dynamickú nestabilitu mikrotubulov v bunkách MCF7. Parametre rastu a skracovania a dynamika boli in vitro potlačené nízkymi koncentráciami erucínu (5–15 µM) (Tabuľka 2, Obr). Tieto výsledky naznačujú, že erucín pôsobí v bunkách priamo na samotné mikrotubuly bez podstatnej modifikácie hladín rozpustného tubulínu, čo by zmenilo celkovú hmotnosť polyméru.
Vysoké koncentrácie erucínu (≥50 µM) inhibovali polymerizáciu mikrotubulov v bunkách aj in vitro (ObrJ, L;ObrA, B), ale koncentrácie potrebné na inhibíciu polymerizácie boli oveľa vyššie ako koncentrácie potrebné na zastavenie mitózy a potlačenie dynamiky mikrotubulov v bunkách a na potlačenie dynamiky purifikovaných mikrotubulov (stôl 1, ,2;2; Obr). Táto schopnosť erucínu potláčať dynamiku mikrotubulov pri koncentráciách výrazne nižších, ako sú tie, ktoré sú potrebné na inhibíciu alebo zvýšenie polymérnej hmoty, je mechanicky podobná spôsobu, akým pôsobia taxány, vinca alkaloidy a mnohé ďalšie antimitotické činidlá zacieľujúce na mikrotubuly, vrátane sulforafanu. Tieto činidlá potláčajú dynamiku mikrotubulov pri koncentráciách nižších ako sú tie, ktoré sú potrebné na zvýšenie (ako v prípade taxánov) alebo zníženie ( napr . eribulín, alkaloidy vinca) polymérnej hmoty mikrotubulov.
Spomedzi antimitotických liečiv zameraných na mikrotubuly, ktoré potláčajú dynamiku mikrotubulov ( napr . vinca alkaloidy a taxány), sa špecifické účinky erucínu na rôzne dynamické parametre, napriek jeho oveľa nižšej toxicite, najviac podobajú účinkom vinblastínu. Erucín aj vinblastín inhibujú rast a skracovanie mikrotubulov, zatiaľ čo niekoľko ďalších liečiv depolymerizujúcich mikrotubuly, ako je vinflunín a eribulín, skracovanie výrazne neinhibuje [42] .
Zatiaľ čo mechanizmus, ktorým sa erucín viaže na tubulín alebo mikrotubuly, ešte treba určiť, jednou z možností je, že pôsobí kovalentnou modifikáciou kritického sulfhydrylového zvyšku tubulínu [57] . Štúdia Mi et al . preukázali, že cysteíny v tubulíne sú kovalentne modifikované niekoľkými izotiokyanátmi vrátane sulforafanu [58] .
Erucin ako možný protirakovinový a chemopreventívny prostriedok
Konzumácia hlúbovej zeleniny, najmä brokolice, brokolicových klíčkov a rukoly je v ľudskej strave vysoko rozšírená. Zdá sa jasné, že protirakovinové a chemoprotektívne účinky erucínu a sulforafanu sa vyskytujú v koncentráciách, ktoré sú dosiahnuteľné v ľudskej strave (od 0,1 do 300 µM, prehľad v [15] , [59] ). Izotiokyanáty, vrátane erucínu a sulforafanu, sa rýchlo vstrebávajú do buniek (na milimolárne hladiny) ako konjugáty glutatiónu [GSH] [60] . Erucin a sulforafan majú podobnú rýchlosť absorpcie, rýchlosť eliminácie ich príslušných metabolitov a podobnú priemernú biologickú dostupnosť [15] , [61] .
Je zaujímavé, že erucín a sulforafan [45] vykazujú aktivity zamerané na mikrotubuly, ktoré sú kvalitatívne podobné tým, ktoré vykazujú vysoko cytotoxické protirakovinové lieky zamerané na mikrotubuly, vrátane taxánov, vincas, eribulínu a maytanzinoidov. Ak sa však izotiokyanáty konzumujú v normálnych hladinách v hlúbovej zelenine, nie sú toxické. Dôvodom nedostatočnej toxicity je pravdepodobne relatívne nízka účinnosť izotiokyanátov v porovnaní so silnejšími liekmi zameranými na mikrotubuly. Konkrétne sa poškodenie funkcií bunkových mikrotubulov v bunkách MCF7 vyskytuje v nanomolárnom rozsahu s taxánmi a alkaloidmi vinca, na rozdiel od mikromolárneho rozsahu s izotiokyanátmi, čo je 1000-násobný rozdiel v účinnosti [33] .
Nedávne dôkazy naznačujú, že izotiokyanáty môžu uplatniť svoju protirakovinovú aktivitu samostatne a v kombinácii s chemoterapeutickými liekmi zameranými na mikrotubuly na synergické zvýšenie smrti rakovinových buniek [62] , [63] . Zdá sa rozumné navrhnúť, že potlačenie dynamiky mikrotubulov a poškodenie vysoko citlivých funkcií mikrotubulov erucínom a inými izotiokyanátmi môže byť dôležité pri prevencii a/alebo spomalení proliferácie alebo migrácie premalígnych a/alebo malígnych buniek.
podporujúce informácie
Obrázok S1
Účinky erucínu na acetyláciu mikrotubulov v bunkách MCF7. Bunky sa inkubovali v prítomnosti alebo neprítomnosti erucínu počas 24 hodín (materiály a metódy). Analyzovala sa intenzita fluorescencie acetylovaných mikrotubulov v najmenej 25 interfázových MCF7 bunkách na podmienky (AU, arbitrárne jednotky). Výsledky pochádzajú z najmenej troch nezávislých experimentov. Stĺpce sú ± SEM. Hodnoty s *** sa významne líšia od kontroly pri ≥99,9 % intervale spoľahlivosti podľa Studentovho t -testu.
(TIF)
Poďakovanie
Tento dokument venujeme pamiatke Roya Mankowitza (1941–2011), vedca, právnika, vynálezcu a inšpiratívneho výskumníka wellness, ktorý poskytol dary na podporu tejto štúdie. Ďakujeme tiež pánovi Herbertovi P. Millerovi za prípravu mikrotubulového proteínu použitého v tejto práci a Dr. Nichole E. LaPointemu za pomoc pri príprave figúrok.
Finančný výkaz
Postdoktorandské štipendium pre Olgu Azarenko, Cancer Center of Santa Barbara Research Program, Santa Barbara CA, USA http://www.ccsb.org/Patients_Family/Medical_Care_Support/Research/ . Investori nemali žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu.
