Pridružené údaje
Abstrakt
Rosa gallica je široko používaný druh ruže na lekárske a kulinárske účely. Bolo hlásené, že Rosa gallica vykazuje antioxidačné, protizápalové a antibakteriálne účinky. Účinok Rosa gallica proti starnutiu pokožky in vivo však nie je známy a jej aktívne zložky nie sú úplne pochopené. Perorálne podanie Rosa gallica zabránilo tvorbe vrások kože sprostredkovanej UVB a strate kolagénových/keratínových vlákien v dorzálnej koži myší. Vyšetrenie biomarkerov na molekulárnej úrovni ukázalo, že Rosa gallicadownreguluje UVB-indukovanú expresiu COX-2 a MMP-1 v koži. Prostredníctvom priameho porovnania hlavných zlúčenín identifikovaných pomocou systému UHPLC-MS/MS sme objavili kyselinu galovú ako primárnu zložku, ktorá prispieva k účinku proti starnutiu pokožky, ktorý vykazuje Rosa gallica . Skúmanie molekulárneho mechanizmu odhalilo, že kyselina galová môže silne a selektívne zacieliť na signálnu os c-Raf/MEK/ERK/c-Fos. Okrem toho kyselina galová aj inhibítor MEK blokovali expresiu MMP-1 indukovanú UVB a obnovili hladiny kolagénu v rekonštruovanom 3D modeli ľudskej kože. Súhrnne by sa Rosa gallica mohla použiť ako funkčná zložka pri vývoji nutraceutík proti starnutiu pokožky.
1. Úvod
Chronické ožarovanie ultrafialovým B (UVB) svetlom spôsobuje tvorbu vrások pokožky, zápal, pigmentáciu a dehydratáciu [ 1 , 2 ]. UVB spúšťa signálne dráhy vedúce k upregulácii génov podieľajúcich sa na degradácii kolagénu a zápale [ 1 , 3 ]. Spomedzi nich zohrávajú kľúčovú úlohu pri podpore degradácie kolagénu a následne pri tvorbe vrások matricové metaloproteinázy (MMP), najmä MMP-1 [ 4 ]. Okrem toho, cyklooxygenáza 2 (COX−2), ktorá môže byť indukovaná UVB svetlom, sprostredkuje zápal kože a fotostarnutie [ 5 ]. Potravinové zlúčeniny, ktoré môžu inhibovať expresiu MMP-1 alebo/a COX-2, majú teda potenciál pôsobiť proti starnutiu pokožky [ 6 ,7 ].
Aktivátorový proteín 1 (AP−1) a jeho upstream regulačné dráhy sú známe ako hlavné faktory prispievajúce k expresii MMP–1 a starnutiu kože [ 8 ]. AP-1 je dimérny transkripčný faktor tvorený rodinami Fos (c-Fos, FosB, Fra1 a Fra2) a Jun (c-Jun, JunB a JunD). Aktivácia AP−1 indukuje transkripciu génov zapojených do starnutia kože, bunkovej proliferácie, angiogenézy a zápalu [ 8 , 9 , 10 ]. Najmä preto, že AP-1 priamo indukuje expresiu MMP-1 vedúcu k degradácii kolagénu v koži, downregulácia zložiek AP-1 bola navrhnutá ako sľubná stratégia na blokovanie starnutia pokožky [ 11]. UV spôsobuje aktiváciu mitogénom aktivovaných proteínkináz (MAPK), vrátane ERK1/2, p38 a JNK1/2, ktoré pôsobia ako kľúčové upstream regulátory aktivity AP-1 [8 , 12 ] . Štúdie teda preukázali, že inhibícia upstream regulačných dráh AP-1, ako sú MAPK, MAP2K alebo c-Raf, môže potlačiť starnutie kože [ 13 , 14 , 15 , 16 , 17 ].
Druhy Rosa sa používajú ako prísada do varenia, ako aj ako liečivá rastlina. Uvádza sa , že rôzne druhy ruží, vrátane Rosa canina , Rosa damascene , Rosa centifolia a Rosa gallica, vykazujú antioxidačné, antibakteriálne, antidepresívne a protizápalové vlastnosti [ 18 , 19 ]. Okrem toho je druh Rosa známy pre svoje funkčné účinky na kožu [ 20 , 21 ]. Najmä Rosa gallica je jedným z najčastejšie používaných druhov Rosa na kozmetické, medicínske a kulinárske účely [ 22 , 23 ]. Hoci potenciálExtrakt z Rosa gallica na prevenciu biomarkerov starnutia pokožky in vitro bol publikovaný [ 24 ], neexistuje žiadna štúdia preukazujúca účinok Rosa gallica proti starnutiu pokožky in vivo. Navyše, aktívne zložky zodpovedné za biologickú aktivitu druhov Rosa gallica a Rosa nie sú dostatočne známe. Tu sme orálne podávali extrakt z Rosa gallica myšiam a vyhodnotili sme jeho účinok proti starnutiu pokožky, aby sme vyhodnotili jeho potenciál ako funkčnej potraviny/nutraceutika. Okrem toho sme identifikovali účinnú látku Rosa gallica ultra-vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (UHPLC) s hmotnostnou spektrometriou (MS) a skúmali jej molekulárny mechanizmus.
2. Materiály a metódy
2.1. Materiály
Kyselina galová, kvercetín, katechín, kaempferol, rutín, kvercitrín, U0126, dimetylsulfoxid (DMSO) a kyselina mravčia boli zakúpené od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Protilátka na detekciu COX-2 bola zakúpená od Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) a protilátky na detekciu MMP-1 a kolagénu Ι boli získané od Abcam (Cambridge, Spojené kráľovstvo). Protilátky proti c-Jun, p38, JNK, c-Raf, MKK4, vinculin a GAPDH poskytla Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA). Boli to protilátky na detekciu c-Fos, fosfo-c-Jun, fosfo-ERK, ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, fosfo-c-Raf, fosfo-MEK, MEK, fosfo-MKK4, fosfo-MKK3 a MKK3 zakúpené od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Rosa gallicaokvetné lístky boli dovezené z Turecka prostredníctvom GN Bio (Hanam, Kórea). Voda analytickej čistoty a acetonitril (ACN) boli zakúpené od Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).
2.2. Príprava extraktu z Rosa gallica
Okvetné lístky ruží sa rozdrvili v mixéri, čím sa získal prášok. Sušený prášok (10 g) okvetných lístkov ruže sa zmiešal s 1000 ml 70 % ( obj./obj . ) etanolu a extrahoval sa pri 70 °C počas 3 hodín pomocou spätného chladiča . Potom sa extrakt prefiltroval cez filtračný papier č. 2 (Whatman, Maidstone, UK). Rozpúšťadlo sa následne odparilo a produkt sa lyofilizoval.
2.3. Experimentálne zvieratá a liečby
Samice myší bez srsti SKH-1 boli získané od Orient Bio (Seongnam, Kórea). Myši mali voľný prístup k potrave a vode počas 15 týždňov. Do každej skupiny bolo rozdelených sedem myší. Inštitucionálny výbor pre starostlivosť o zvieratá a ich použitie (SEMI1-19-02) schválil všetky experimentálne protokoly. Extrakt z Rosa gallica sa rozpustil v destilovanej vode v uvedenej koncentrácii a každý deň sa podával myšiam orálnou sondou. UVB bolo aplikované na myši pomocou UV-3000 (Dong Seo Science Co., Ltd., Soul, Kórea) počnúc 5. týždňom experimentu. UVB ožarovanie sa postupne zvyšovalo z 1 MED na 4 MED (1 MED = 1 minimálna dávka erytému = 50 mJ/cm2 ) bez poškodenia.
2.4. Meranie vrások
Kožné repliky dorzálnej kože myši boli vyrobené pomocou SILFLO (Amique Group Co. Ltd., Tokio, Japonsko) na konci experimentov. Repliky kože boli odfotografované pomocou Nikon E600 (Nikon, Tokio, Japonsko). Hĺbka vrások bola meraná pomocou Visioline® VL 650 (Courage&Khazaka GmbH, Koln, Nemecko).
2.5. Massonovo trichrómové farbenie
Tkanivové vzorky sa fixovali 4% ( obj./obj . ) roztokom formalínu. Tkanivo bolo zaliate do parafínu. Rezy s hrúbkou približne 4 μm boli zafarbené pomocou Massonovho trichrómu na analýzu kolagénových a keratínových vlákien. Po zafarbení tkaniva sa sklíčka skúmali pri 200-násobnom zväčšení pomocou Nikon DS-Fi3 (Nikon).
2.6. Imunoblot
Kožné tkanivá alebo bunky boli lyzované pufrom RIPA. Imunoblot sa uskutočnil tak, ako už bolo opísané [ 25 ]. Stručne, lyzáty sa centrifugovali pri 4 ° C, 12 000 x g počas 10 až 20 minút. Proteínová koncentrácia lyzátu bola meraná pomocou BCA testu (Thermo Fisher Scientific). Proteíny boli oddelené pomocou SDS-PAGE a prenesené na nitrocelulózovú (NC) membránu ( PALL®Corporation, Port Washington, NY, USA). NC membrána bola blokovaná v 5% odstredenom mlieku v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku v 0,1% Tween 20 počas 1 hodiny. Membrána sa cez noc inkubovala s primárnou protilátkou pri 4 °C. Pásy boli detegované pomocou Western Lightning Plus-ECL (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) po inkubácii so sekundárnou protilátkou konjugovanou s HRP. Všetky bloty uvedené v rukopise pochádzajú z filmového skenu generovaného z automatického röntgenového filmového procesora (JPI Healthcare, Soul, Kórea).
2.7. Podmienky UHPLC-LTQ-Orbitrap/MS/MS
Molekulové hmotnosti píkov boli zobrazené z MS s vysokým rozlíšením pomocou LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific) v spojení s Accelar UHPLC (Thermo Fisher Scientific). Mobilná fáza A bola voda obsahujúca 0,1 % ( v / v ) kyseliny mravčej a mobilná fáza B bola ACN obsahujúca 0,1 % ( v / v ) kyseliny mravčej. Separácia zlúčenín sa uskutočnila pomocou kolóny C18 ( Acquity UPLC®BEH; 2,1 mm x 100 mm, 1,7 μm; Waters Corp., Milford, MA, USA) pri prietokovej rýchlosti 0,4 ml/min s použitím nasledujúceho gradientu 3–10 % mobilnej fázy B počas 3 minút; 10-40% B počas 16 minút; 40-80 % B počas 17 minút; 80-3 % B počas 19 minút; 3 % B počas 20 minút. UHPLC-MS/MS bola prevádzkovaná so Z-sprejovým iónovým zdrojom v režime kladných iónov, záporných iónov s použitím nasledujúcich podmienok: kapilárne napätie 20 V, kapilárna teplota 350 °C, rozprašovacie napätie 3,5 kV. Spektrá boli snímané v rozsahu medzi 150 a 1500 m/z .
2.8. Bunková kultúra a UVB ožarovanie
Ľudské dermálne fibroblasty (HDF) láskavo poskytol Dr. Jin Ho Chung (Department of Dermatology, Soul National University College of Medicine, Soul, Kórea). HDF boli kultivované v Dulbecco’s Modified Eagle’s Media (DMEM, Corning Inc., Somerville, MA, USA) obsahujúcom 10 % fetálneho hovädzieho séra (FBS, Thermo Fisher Scientific) s penicilínom/streptomycínom (Corning Inc.). Bunky boli ožiarené UVB pomocou Bio-link-BLX (Vilber Lourmat, Paríž, Francúzsko), s vlnovou dĺžkou maximálnej emisie 312 nm. Energia UV bola 0,03 J/ cm2 .
2.9. Farbenie SRB
HDF sa naočkovali do 6-jamkovej platne. Po 24 hodinách sa médium nahradilo DMEM bez séra. Nasledujúci deň boli chemikálie ošetrené v uvedených koncentráciách a inkubované počas 48 hodín. Po fixácii buniek sa živé bunky zafarbili sulforhodamínom B (SRB, Sigma-Aldrich). SRB sa rozpustil v 10 mM Tris a absorbancia sa merala pri 554 nm.
2.10. Enzymovo viazaný imunosorbentový test (ELISA)
HDF sa naočkovali na 12-jamkové platne v hustote 1,8 x 105 buniek /jamku. Bunky sa inkubovali 24 hodín, potom sa médium nahradilo médiom bez séra a inkubovalo sa ďalších 24 hodín. Bunky sa ošetrili zlúčeninami v uvedených koncentráciách a potom sa ožiarili UVB. Po 48 hodinách inkubácie sa kultivačné supernatanty zhromaždili a centrifugovali pri 13 000 x g , aby sa odstránili bunkové zvyšky. Koncentrácia MMP-1 v kultivačnom médiu pre bunky bola stanovená zodpovedajúcimi súpravami ELISA (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA). Tieto testy sa uskutočňovali podľa pokynov výrobcu.
2.11. Zrekonštruovaný 3D model ľudskej kože
Rekonštruovaná 3D ľudská koža (Neoderm−ED) bola získaná od Tegoscience (Soul, Kórea). Rekonštruovaný 3D model ľudskej kože bol ošetrený indikovanými chemikáliami počas 1 hodiny pred UVB ožiarením. Kožné tkanivo sa ožarovalo UVB dvakrát denne počas 8 dní a médium sa menilo každé dva dni. Kožné tkanivo sa inkubovalo pri 37 °C v atmosfére 5 % C02 .
2.12. Farbenie kolagénu v rekonštruovanom 3D modeli ľudskej kože
Rezy kože z rekonštruovaného 3D modelu ľudskej kože boli fixované 4% roztokom formalínu. Rezy zaliate parafínom sa narezali na podložné sklíčka. Sklíčka boli trikrát zbavené parafínu xylénom a hydratované cez alkoholový kúpeľ. Deparafinizované rezy boli zafarbené roztokom Sirius Red/Fast Green (Chondrex, Inc. Woodinville, WA, USA). Po zafarbení tkaniva sa sklíčka premyli 0,5 % ( v / v ) roztokom kyseliny octovej. Nakoniec boli sklíčka dehydratované cez alkoholový kúpeľ s reverznou kvalitou a pripevnené. Obrázky kolagénom zafarbených sklíčok boli urobené pomocou Nikon eclipse Ts2 (Nikon).
2.13. Štatistická analýza
Na štatistické analýzy sa použila jednosmerná analýza rozptylu nasledovaná softvérom GraphPad Prism 5 (San Diego, CA, USA). Všetky údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). A p < 0,05 sa považovalo za štatisticky významné.
3. Výsledky
3.1. Orálna konzumácia extraktu z lupeňov Rosa gallica (RPE) potláča UVB-sprostredkované vrásky pokožky in vivo
Myšiam bol podávaný extrakt z okvetných lístkov Rosa gallica (RPE) a vystavené UVB žiareniu počas 10 týždňov (postava 1A). Nepretržité vystavenie UVB žiareniu, tvorba vrások na koži (postava 1B). Je zaujímavé, že perorálne podanie RPE v dávke 5 a 10 mg/kg telesnej hmotnosti viedlo k zníženiu tvorby vrások sprostredkovaných UVB na dorzálnej koži myší (postava 1B). Kvantifikácia kožných vrások preukázala, že podávanie RPE môže blokovať strednú hĺbku vrások vyvolanú UVB a maximálnu hĺbku vrások na takmer kontrolné úrovne (postava 1C). Tieto výsledky jasne ukazujú, že perorálny príjem RPE môže potlačiť starnutie pokožky sprostredkované UVB žiarením in vivo.
Výťažok z ružových lístkov (RPE) potláča tvorbu vrások na pokožke vyvolanú UVB žiarením. ( A ) RPE bol orálne podávaný myšiam každý deň. UVB sa ožarovalo trikrát týždenne, ako je uvedené v experimentálnej schéme. ( B ) Reprezentatívne obrázky repliky kože. ( C ) Bola kvantifikovaná stredná hĺbka vrások a maximálna hĺbka vrások. Údaje predstavujú priemer ± SD ( n = 4). Významné rozdiely medzi neliečenou kontrolnou skupinou a skupinou liečenou iba UVB (# p < 0,05) a významné rozdiely medzi skupinou, ktorej sa podávalo UVB a UVB + RPE (* p < 0,05, ** p < 0,01).
3.2. RPE nevykazuje vedľajšie účinky in vivo
Na posúdenie bezpečnosti RPE in vivo sme hodnotili niekoľko parametrov po podaní RPE. RPE nevykazoval viditeľné účinky na telesnú hmotnosť myší (Obrázok 2A). Okrem toho RPE neovplyvnil množstvo príjmu potravy a vody (Obrázok 2B, C). Okrem toho RPE nespôsobila žiadnu zmenu hmotnosti pečene u myší (Obrázok 2D). Súhrnne tieto výsledky demonštrujú, že orálna konzumácia RPE negeneruje vedľajšie účinky in vivo pri ošetrených koncentráciách.
RPE nevykazuje toxicitu v testovaných koncentráciách. ( A – C ) Telesná hmotnosť ( n = 7), príjem potravy ( n = 4) a príjem vody ( n = 4) boli merané dvakrát týždenne. ( D ) Hmotnosť pečene sa merala po usmrtení myší na konci experimentu ( n = 7). Údaje predstavujú priemer ± SD. Medzi všetkými skupinami nebol žiadny významný rozdiel (ns).
3.3. RPE inhibuje degradáciu kolagénu a blokuje UVB-sprostredkovaný biomarker starnutia pokožky
Aby sme ďalej preskúmali účinok RPE proti starnutiu pokožky, analyzovali sme kľúčové biomarkery starnutia pokožky. Kolagén a keratín sú hlavné štrukturálne proteíny tvoriace kožu a je známe, že redukcia týchto proteínov je zodpovedná za tvorbu vrások na koži [ 26 , 27 ]. Výsledky z Massonovho trichrómového farbenia kože ukazujú, že RPE môže zabrániť poklesu hladín kolagénu a keratínu v koži spôsobeného UVB (Obrázok 3A). Zistili sme tiež, že RPE potláča UVB-indukovanú expresiu COX-2 a MMP-1 v koži (Obrázok 3B), čo naznačuje, že RPE môže blokovať hlavné mediátory zápalu a degradácie kolagénu. Aj keď existovala predchádzajúca správa, že RPE môže oslabiť MMP-1 v bunkách, toto je prvýkrát, čo ukazuje, že RPE môže potlačiť expresiu MMP-1, ako aj degradáciu kolagénu a tvorbu vrások in vivo .
RPE inhibuje degradáciu kolagénu a zvráti biomarkery starnutia pokožky. ( A ) Massonovo trichrómové farbenie na vizualizáciu kolagénových a keratínových vlákien v kožnom tkanive myši. Kolagénové vlákna sú modré a keratínové vlákna červené. Stĺpec stupnice ukazuje 100 μm. ( B ) Proteínová expresia MMP-1, COX-2 a vinkulínu sa stanovila v lyzátoch myšacieho tkaniva pomocou zodpovedajúcej protilátky. Boli použité tkanivové lyzáty od troch myší na skupinu. Vinculin sa použil ako kontrola zaťaženia.
3.4. Identifikácia zlúčenín v Rosa gallica
Hlavné fragmentové ióny RPE získané pomocou UHPLC–LTQ–Orbitrap/MS/MS sú uvedené vObrázok 4. Celkovo bolo identifikovaných 17 píkov okrem píku rozpúšťadla (tab.1). Predbežná identifikácia sa uskutočnila pomocou získaného prekurzorového iónu a jeho fragmentových iónov. Kyselina galová (1) a katechín (2), ktoré sú relatívne polárne zlúčeniny, boli detegované rýchlo s krátkymi retenčnými časmi v podmienkach reverznej fázy. Zlúčeniny, v ktorých sú dva glykozidy naviazané na kvercetín (ako je rutín, hodnota fragmentového iónu 303,05 m / z ), boli identifikované v relatívne krátkych retenčných časoch, po ktorých nasledoval monoglykozid (kvercetín 303,05 m / z a kaempferol 287,05 m / z) a aglykónového (dihydrokaempferolového) typu. V tejto štúdii, keďže väzbové štruktúry glykozidovej skupiny nie sú jasné, bola exprimovaná ako diglykozid. Spomedzi identifikovaných zlúčenín bolo 11 píkov identifikovaných ako deriváty kvercetínu (vrcholy č. 5, 6, 7, 8, 11, 14 a 15) alebo kaempferolu (vrcholy č. 9, 10, 13 a 17), ktorý je v v súlade s predchádzajúcimi správami, kde sú glykozidy kvercetínu a kempferolu najhojnejšími flavonoidmi v ružiach spomedzi uvedených zlúčenín [ 28 , 29 , 30 ].
tab.1
Identifikácia hlavných chemických zložiek v RPE pomocou UHPLC-LTQ-Orbitrap/MS/MS.
| Vrchol | t R (min) |
Molekulová hmotnosť | Iónový režim | Prekurzorový ión ( m/z ) | Fragmentové ióny ( m/z ) | Predbežná identifikácia | Odkaz |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2.16 | 170,1195 | [M – H] – | 169 0000 | ND | Kyselina galová | [ 30 ] |
| 2 | 4.04 | 290,2681 | [M + H] + | 291,0864 | ND | katechín | [ 29 ] |
| 3 | 4.28 | 954,7038 | [M + H] + | 955,1054 | ND | Rugosin B | [ 28 ] |
| 4 | 6,50 | 936,6454 | [M + H] + | 937,0934 | ND | Casuarictin | [ 31 ] |
| 5 | 7.45 | 616,4806 | [M + H] + | 617,1137 | 303,0499 | Kvercetín-3- O -galát-glukozid | [ 32 ] |
| 6 | 8:00 | 610,5175 | [M + H] + | 611,1607 | 465,1029, 303,0500 | Rutín | [ 30 ] |
| 7 | 8.28 | 464,3763 | [M + H] + | 465,1028 | 303,0499 | kvercetín-3-0 – galaktozid | [ 28 , 33 ] |
| 8 | 8.56 | 464,3763 | [M + H] + | 465,1026 | 303,0498 | Kvercetín-3- O -glukozid | [ 30 , 33 ] |
| 9 | 9.51 | 448,3769 | [M + H] + | 449,1078 | 287,0549 | Kaempferol-3- O -galaktozid | [ 28 , 33 ] |
| 10 | 10:00 | 448,3769 | [M + H] + | 449,1080 | 287,0550 | Kaempferol-3- O -glukozid | [ 30 , 33 ] |
| 11 | 10.20 | 448,3769 | [M + H] + | 449,1078 | 303,0498 | kvercitrín | [ 30 ] |
| 12 | 11,94 | 438,5128 | [M – H] – | 437,1445 | ND | neznámy | |
| 13 | 12.44 | 432,3775 | [M + H] + | 433,1130 | 287,0550 | Kaempferol-3- O -ramnozid | [ 30 ] |
| 14 | 13.10 | 652,5542 | [M + H] + | 653,1712 | 303,0500 | Diglykozid kvercetín | [ 30 ] |
| 15 | 14,78 | 636,5548 | [M + H] + | 637,1764 | 303,0500 | Diglykozid kvercetín | [ 30 ] |
| 16 | 16,96 | 583,6741 | [M + H] + | 584,2754 | 438,2387 | Trikumaroyl spermidín | [ 34 ] |
| 17 | 19.12 | 288,2522 | [M + H] + | 289,2373 | 271,2268 | Dihydrokaempferol | [ 35 ] |
RPE, extrakt z ružových lístkov; UHPLC-LTQ-Orbitrap/MS/MS, ultra vysokoúčinná kvapalinová chromatografia a tandemová hmotnostná spektrometria; tR , retenčný čas; ND, nezistené.
3.5. Kyselina galová je hlavnou aktívnou zložkou Rosa gallica pri prevencii starnutia pokožky
Na základe výsledkov chemickej analýzy (Obrázok 4atab.1), na ďalšie hodnotenie sme vybrali kyselinu galovú, kvercetín, katechín, kempferol, rutín a kvercitrín. Inhibičná aktivita proti MMP-1 sa merala použitím šiestich zlúčenín. Liečba kyselinou galovou vykazovala najsilnejšie zníženie hladín MMP-1 indukovaných UVB medzi testovanými zlúčeninami bez akejkoľvek zjavnej cytotoxicity (Obrázok 5A, B). Okrem toho bola kyselina galová schopná potlačiť hladiny MMP-1 spôsobom závislým od dávky (Obrázok 5C), čo naznačuje, že kyselina galová je hlavným faktorom prispievajúcim k účinku proti starnutiu pokožky, ktorý vykazuje RPE.
Účinok jednotlivých zlúčenín v RPE na UVB-indukovaný MMP-1. ( A ) Životaschopnosť buniek sa merala po ošetrení buniek kyselinou galovou (GA), kvercetínom (Qc), katechínom (Ca), kemferolom (Kp), rutínom (Ru), kvercitrínom (Qi) počas 48 hodín (n = 5 ) . ( B ) Ľudské dermálne fibroblasty (HDF) boli vopred ošetrené zlúčeninami v uvedených koncentráciách počas 1 hodiny pred vystavením UVB. Po 48 hodinách sa merala produkcia MMP-1 v kultivačnom médiu pomocou ELISA ( n = 3). Údaje predstavujú mieru inhibície MMP-1 v porovnaní so skupinou liečenou iba UVB. ( C ) HDF boli vopred ošetrené kyselinou galovou (GA). Koncentrácia MMP-1 sa merala pomocou ELISA ( n= 3). Údaje predstavujú priemer ± SD. Signifikantné rozdiely medzi neliečenou kontrolnou skupinou a skupinou liečenou iba UVB (## p < 0,01) a významné rozdiely medzi skupinou liečenou UVB a UVB + GA (* p < 0,05, ** p < 0,01).
3.6. Kyselina galová sa zameriava na signálnu dráhu c-Raf
Aby sme pochopili molekulárny mechanizmus kyseliny galovej, skúmali sme účinok kyseliny galovej na signalizáciu sprostredkovanú UVB. Keďže AP−1 je kľúčovým transkripčným faktorom riadiacim expresiu MMP−1 [ 4 ], snažili sme sa otestovať účinok kyseliny galovej na jednotlivé faktory tvoriace dimér AP−1. Kyselina galová znížila reguláciu c-Fos, zatiaľ čo fosforylácia c-Jun nebola ovplyvnená (Obrázok 6A). Keďže je známe, že expresia c-Fos je primárne regulovaná členmi rodiny MAPK (tj ERK1/2, p38 a JNK1/2) [8], skúmali sme účinok kyseliny galovej proti aktivácii MAPK. Zistili sme, že kyselina galová môže silne a selektívne potlačiť fosforyláciu ERK1/2, pričom nevykazuje žiadne viditeľné účinky na fosforylácie JNK1/2 a p38 (Obrázok 6B). Kyselina galová tiež zoslabila fosforyláciu MEK1/2, ktorá je priamym upstream regulátorom ERK1/2 (Obrázok 6C). c−Raf je aktivovaný UV žiarením a pôsobí ako upstream regulátor dráhy MEK/ERK [ 36 ]. Výsledky ukazujú, že kyselina galová môže výrazne znížiť aktiváciu c-Raf (Obrázok 6C). Okrem toho kyselina galová neovplyvnila fosforylácie MKK4 a MKK3/6, čo ďalej naznačuje, že kyselina galová prednostne inhibuje dráhu c-Raf/MEK (Obrázok 6C). Celkovo tieto výsledky ukazujú, že kyselina galová sa môže selektívne zamerať na dráhu c-Raf/MEK/ERK/c-Fos.
Účinok kyseliny galovej (GA) na signálne dráhy indukované UVB. ( A ) Proteínová expresia c-Fos, vinkulínu, p-c-Jun a c-Jun sa stanovila v lyzátoch ľudských fibroblastových buniek pomocou zodpovedajúcej protilátky. Vinculin sa použil ako kontrola zaťaženia. ( B ) Účinok GA na dráhu MAPK v HDF. Hladiny proteínovej expresie fosforylovaného a celkového ERK, JNK, p38 a vinkulínu boli stanovené v bunkových lyzátoch s použitím zodpovedajúcej protilátky imunoblotovaním. Vinculin sa použil ako kontrola zaťaženia. ( C) Účinok GA na dráhu c-Raf a MAP2Ks v HDF. Hladiny proteínovej expresie fosforylovaného a celkového c-Raf, MEK1/2, MKK4 a MKK3 a vinkulínu boli stanovené v bunkových lyzátoch pomocou zodpovedajúcej protilátky imunoblotovaním. Vinculin sa použil ako kontrola zaťaženia.
3.7. Inhibícia MEK a kyselina galová blokuje expresiu MMP-1 indukovanú UVB a redukciu kolagénu v rekonštruovanom 3D modeli ľudskej kože
Keďže kyselina galová selektívne inhibovala signálnu os c-Raf/MER/ERK, použili sme selektívny inhibítor MEK (tj U0126) na potvrdenie zapojenia tejto signálnej dráhy do expresie MMP-1 a kolagénu. U0126 potlačil UVB-indukovaný MMP-1 v HDF, čo dokazuje, že aktivácia signalizácie c-Raf/MER/ERK je nevyhnutná pre produkciu MMP-1 (Obrázok 7A). Ďalej sme použili rekonštruovaný 3D model ľudskej kože na skúmanie vplyvu U0126 a kyseliny galovej na kontrolu hladín MMP-1 a kolagénu. Rekonštruované 3D tkanivá ľudskej kože boli ošetrené U0126, kyselinou galovou alebo oboma a ožiarené UVB žiarením počas 8 dní. Kyselina galová aj U0126 downregulovali UVB-indukovanú expresiu MMP-1 a zabránili UVB-indukovanému poklesu kolagénu (Obrázok 7B, C).
Účinok U0126 a kyseliny galovej na expresiu MMP-1 a kolagénu v rekonštruovanom 3D modeli ľudskej kože. ( A ) HDF boli vopred ošetrené U0126. Koncentrácia MMP-1 sa merala pomocou ELISA ( n = 3). Údaje predstavujú priemer ± SD. Signifikantné rozdiely medzi neliečenou kontrolnou skupinou a skupinou liečenou iba UVB (### p < 0,001) a významné rozdiely medzi skupinou liečenou UVB a UVB + U0126 (*** p < 0,001). ( B ) Účinok GA a U0126 na MMP-1 a kolagén v rekonštruovanom 3D modeli ľudskej kože. GAPDH sa použil ako kontrola zaťaženia. ( C ) Kolagén bol zafarbený v rezoch z rekonštruovaného 3D modelu ľudskej kože pomocou roztoku Sirius Red/Fast Green. Stĺpec stupnice ukazuje 50 μm.
4. Diskusia
V súčasnej štúdii bol RPE orálne podávaný myšiam a skúmal sa jeho ochranný účinok proti starnutiu kože. Zatiaľ čo predchádzajúca štúdia uvádzala účinok RPE proti starnutiu kože vyvolanému UVB v podmienkach in vitro [ 24 , 37 ], účinnosť RPE in vivo nebola známa. Toto je prvá správa, ktorá demonštruje, že perorálne podanie Rosa gallica môže blokovať starnutie pokožky in vivo sprostredkované UVB bez akejkoľvek výraznej toxicity. Tieto výsledky naznačujú, že RPE môže byť sľubným nutraceutickým činidlom na prevenciu starnutia pokožky.
Zatiaľ čo predchádzajúce štúdie uvádzali bioaktivity Rosa gallicaaktívne zložky zostali nepolapiteľné. Identifikácia aktívnych zlúčenín je kľúčovým krokom k pochopeniu mechanizmu prírodných činidiel, ako aj k jeho vývoju pre praktické aplikácie. Aktívna zlúčenina sa môže použiť ako marker na kontrolu kvality alebo na optimalizáciu podmienok spracovania prírodného činidla. Kombináciou chemickej analýzy na báze UHPLC-MS/MS a hodnotenia aktivity sme identifikovali kyselinu galovú ako aktívnu zlúčeninu, ktorá môže aspoň čiastočne rekapitulovať účinok proti starnutiu pokožky vyvolaný RPE. Kyselina galová bola vybraná ako hlavná aktívna zlúčenina, pretože vykazovala najsilnejší inhibičný účinok proti expresii MMP-1 v porovnaní s inými zlúčeninami z RPE. Aj keď sú kvercetín a katechín slabší ako kyselina galová, vykazujú aj inhibičnú aktivitu proti expresii MMP-1 (Obrázok 5B). To je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami, ktoré tiež uvádzajú potenciál kvercetínu a katechínu proti starnutiu pokožky [ 38 , 39 ]. Ochranný účinok RPE proti starnutiu pokožky možno teda pripísať kombinácii viacerých zložiek. Na základe našich výsledkov bola kyselina galová vybraná ako hlavná aktívna zložka, avšak ďalšie štúdie na vyhodnotenie aktivity iných zlúčenín by mohli pomôcť plne pochopiť funkciu Rosa gallica .
Keď sme skúmali zložky RPE, veľkú časť medzi identifikovanými zlúčeninami tvorili glykozidové deriváty kvercetínu a kaempferolu (tab.1). Rutín a kvercitrín vykazovali výrazne slabšiu biologickú aktivitu v porovnaní s ich aglykónovou zlúčeninou, kvercetínom (Obrázok 5B), čo je v súlade s predchádzajúcimi správami, kde odstránenie cukrových skupín vo všeobecnosti zvyšuje biologickú aktivitu zlúčeniny [ 40 , 41 , 42 , 43 ]. V súlade s tým, aj keď sme neboli schopní otestovať všetky zlúčeniny nachádzajúce sa v extrakte, berúc do úvahy, že kempferol vyvolal v testovaných podmienkach menšie účinky (Obrázok 5B), je pravdepodobné, že iné glykozidické deriváty kaempferolu nájdené v RPE by tiež mali relatívne nevýznamné účinky na expresiu MMP-1. Existuje však možnosť, že iné zlúčeniny s odlišnými štruktúrami nájdené v RPE by mohli prispieť k účinku Rosa gallica proti starnutiu pokožky .
Preskúmali sme molekulárny mechanizmus kyseliny galovej a zistili sme, že kyselina galová môže selektívne inhibovať c-Raf, MEK, ERK a c-Fos, pričom nevykazuje žiadne viditeľné účinky voči iným členom rodiny MAPK a MAP2K. Predtým sa uvádzalo, že kyselina galová má účinky proti starnutiu pokožky; zodpovedný spôsob účinku bol však do značnej miery neznámy [ 44 , 45 ]. Uvádzame, že kyselina galová môže inhibovať UVB-indukovanú signálnu os c-Raf/MEK/ERK/c-Fos v HDF, a to môže byť hlavný mechanizmus na vysvetlenie downregulácie MMP-1 riadenej kyselinou galovou. Okrem toho je známe, že signálna dráha c–Raf/MEK/ERK hrá rozhodujúcu úlohu vo vývoji rôznych druhov rakoviny, vrátane melanómu, nemelanómovej rakoviny kože, rakoviny pankreasu a nemalobunkového karcinómu pľúc [ 4647 , 48 ] . Vzhľadom na to, že látky zacielené na dráhu c-Raf majú chemopreventívne/chemoterapeutické účinky proti týmto typom rakoviny [ 47 , 49 ], kyselina galová môže tiež potenciálne potlačiť karcinogenézu.
Pri vysokých koncentráciách môžu fytochemikálie vykazovať toxicitu, avšak pri nízkych koncentráciách môžu modulovať rôzne fyziologické dráhy, čo potenciálne prináša zdravotné výhody. Koncept hormézy bol aplikovaný na pochopenie mechanizmu terapeutických účinkov uvádzaných prírodnými produktmi [ 50 , 51 ]. Spomedzi nich bola aktivácia dráh bunkovej stresovej reakcie navrhnutá ako jeden z potenciálnych spôsobov pôsobenia fytochemikálií [ 51 ]. V skutočnosti sa mnohé fytochemikálie podieľajú na kontrole bunkových antioxidačných systémov, ako aj signálnych transdukčných dráh [ 51 , 52 ]. Okrem zacielenia na signalizačnú os c-Raf/MEK/ERK/c-Fos, Rosa gallicaa kyselina galová môžu pôsobiť proti starnutiu pokožky prostredníctvom ovplyvňovania regulátorov oxidačného stresu. Uvádza sa, že kyselina galová moduluje dráhu Keap1/Nrf2/ARE [ 53 , 54 ] a je známe, že Roses vykazuje antioxidačné účinky v bunkových modeloch [ 37 , 55 ]. Tieto vlastnosti Rosa gallica a kyseliny galovej mohli poskytnúť bunkovú ochranu prostredníctvom regulácie koncentrácie voľných radikálov a následných zápalových reakcií v pokožke, čo viedlo k zmierneniu starnutia pokožky.
5. Závery
Rosa gallica je jedlý kvet, ktorý sa používa ako prísada v tradičnej medicíne a kulinárskych postupoch. Zistili sme, že Rosa gallica môže poskytnúť ochrannú funkciu proti starnutiu pokožky in vivo. Zdá sa, že kyselina galová funguje ako aktívna zlúčenina Rosa gallica prostredníctvom inhibície signálnej dráhy c-Raf (Obrázok 8). Objavenie možnosti Rosa gallica ako potravinového prostriedku proti starnutiu pokožky otvára nové možnosti využitia ružových lístkov ako nutraceutika.
Schematický diagram zhŕňajúci účinok Rosa gallica proti starnutiu pokožky a jej mechanizmus.
Autorské príspevky
Konceptualizácia, SJ, T.-GN, T.-GL, SB; formálna analýza, SJ, Y.-SJ, Y.-RC, J.-WS, W.-CL; vyšetrovanie, SJ, Y.-SJ, Y.-RC, J.-WS, W.-CL; správa údajov, SJ, Y.-SJ, T.-GL, SB; písanie—pôvodná príprava návrhu, SJ, Y.-SJ, SB; písanie – recenzia a úprava, T.-GN, T.-GL, SB; vizualizácia, SJ; dozor, T.-GL, SB; administrácia projektu, T.-GL, SB; získanie financovania, T.-GL, SB Všetci autori si prečítali a súhlasili s uverejnenou verziou rukopisu.
Financovanie
Tento výskum bol financovaný Ministerstvom vedy a IKT a grantom Národnej výskumnej nadácie Kórey (NRF) financovaným kórejskou vládou (MSIT), číslo grantu 2020R1C1C100467011 pre TL a grant Národnej výskumnej nadácie Kórey (NRF) financovaný Kórejská vláda (Ministerstvo vedy, IKT a plánovania budúcnosti), číslo grantu 2020R1A2C1010703 pre SB
Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady
Štúdiu schválila Inštitucionálna hodnotiaca rada (alebo Etická komisia) Výboru pre inštitucionálnu starostlivosť o zvieratá a ich používanie (kód protokolu SEMI1–19–02).
Vyhlásenie informovaného súhlasu
Nepoužiteľné.
Vyhlásenie o dostupnosti údajov
Údaje sú obsiahnuté v článku.
Konflikt záujmov
Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.
Poznámky pod čiarou
Poznámka vydavateľa: MDPI zostáva neutrálny, pokiaľ ide o jurisdikčné nároky v publikovaných mapách a inštitucionálnych pridruženiach.
